TFF tangentsiaalse voolu filtreerimine koos ultratsentrifuugimisega tõhusaks väikeste ekstratsellulaarsete vesiikulite ettevalmistamiseks

Väikesed ekstratsellulaarsed vesiikulid (sEV) on nanomõõtmelised vesiikulid, mida eritavad rakud, mis sisaldavad nukleiinhappeid, valke, väikeseid molekule ja muid komponente ning millel on oluline roll rakkudevahelises suhtluses. Eksosoomi-tüüpi väikesed ekstratsellulaarsed vesiikulid jagavad suuri sarnasusi nende vanemrakkudega. Võrreldes kunstlike nanoosakestega on neil madalam immuunkliirensi määr ja madalam tsütotoksilisus, mistõttu on need paljulubavad kandidaadid kui uudsedin vivo ravimite kohaletoimetamise vahendid. Peaaegu igat tüüpi rakud võivad neid vesiikuleid sekreteerida ja uuringud nende kasutamise kohta ravimikandjatena liiguvad järk-järgult laborist kliiniliste rakenduste poole. Siiskisuur{0}}tootmine on endiselt suur kitsaskoht.

 

Praegused meetodid ekstratsellulaarse vesiikulite eraldamiseks

Praegused ekstratsellulaarsete vesiikulite eraldamise meetodid hõlmavadultratsentrifuugimine, tihedusgradienttsentrifuugimine, suurus{0}}eralduskromatograafia (SEC) ja polüetüleenglükooli (PEG) sadestamine.

PEG-sadestamine pakub suurt saagist ja lihtsat tööd, kuid seda seostatakse olulise saastumisega soovimatute valkudega. Tihedusgradienttsentrifuugimine ja suurus{1}}eralduskromatograafia võivad anda kõrge puhtusastmega tooteid, kuid nende tõhusus on suhteliselt madal ja protsessid{3}}aeganõudvad. Ultratsentrifuugimist kasutatakse laialdaselt, kuid selle töötlemismahtu piirab tsentrifuugi võimsus, mis muudab selle suurendamise keeruliseks.

 

Tangentsiaalse voolu filtreerimise rakendamine sEV eraldamiseks

Tangentsiaalset voolufiltrit (TFF) on juba rakendatud nanoosakeste, näiteks liposoomide ja lentiviiruse vektorite eraldamiseks. TFF-is voolab sööt tangentsiaalselt üle membraani pinna, mis aitab vähendada membraani saastumist ja hõlbustab protsessi suurendamist.

Kuna väikesed ekstratsellulaarsed vesiikulid ulatuvad üldiselt alates30-200 nmläbimõõduga, a0,45 μm membraanikassettsaab valida TFF-süsteemis suuremate valkude ja vesiikulite eemaldamiseks, samas kui a300 kDa membraanikassettsaab kasutada väikese molekulmassiga{0}}valkude eemaldamiseks ja kultuurisöötmes olevate väikeste ekstratsellulaarsete vesiikulite kontsentreerimiseks.

 

Tooraine iseloomustus pärast TFF-i eraldamist

Nanoosakeste jälgimise analüüs (NTA) näitas, et osakeste läbimõõt jaotus peamiselt vahemikus0–250 nm.

 

 

Transmissioonelektronmikroskoopia (TEM) näitas aga suures koguses saastavat valku, samas kui rakuväliseid vesiikuleid ei täheldatud. Need tulemused näitasid, et ekstratsellulaarsete vesiikulite edasiseks puhastamiseks oli vaja täiendavat allavoolu puhastamisetappi.

 

TFF-kontsentraadi iseloomustus pärast 100 kDa ultrafiltratsiooni

TFF kontsentraati töödeldi edasi, kasutades a100 kDa ultrafiltratsioonitoru.

NTA näitas, et ühe ja kahe ultrafiltrimise järel saadud kontsentraatide osakeste läbimõõt jäi peamiselt vahemikku0–250 nm. Ultrafiltreerimise kahekordne läbiviimine tõi aga kaasa saadud osakeste arvu olulise vähenemise.

TEM-analüüs näitas, et ei ühekordses ega kahekordses ultrafiltratsioonikontsentraadis ei täheldatud vesiikulite{0}sarnaseid struktuure, samas kui märkimisväärne kogus saastavat valku jäi alles.

Seetõttu100 kDa ultrafiltratsiooni ei saanud tõhusalt kasutada söötme puhastamiseks pärast TFF kontsentreerimist.

 

 

Ultratsentrifuugimisega puhastatud TFF-kontsentraadi iseloomustus

NTA näitas, et puhastatud toodete osakeste läbimõõt jaotus peamiselt vahemikus0–250 nm.

Oluline on see, et TEM näitas selgelt vesiikulite{0}}sarnaseid struktuure erinevates vaateväljades. Need tulemused näitasid, et pärast söötme kontsentreerimist TFF-iga,Ultratsentrifuugimist saab seejärel kasutada ekstratsellulaarsete vesiikulite edasiseks eraldamiseks ja puhastamiseks.

 

 

Mesenhümaalsete tüvirakkude konditsioneeritud söötmest eraldatud sEV-de iseloomustus, kasutades TFF-i koos ultratsentrifuugimisega

NTA näitas, et puhastatud toodete osakeste läbimõõt jaotus peamiselt vahemikus0–250 nm.

Vesiikulite{0}}sarnaseid struktuure jälgis TEM. Western blot analüüs näitas ekstratsellulaarse vesiikuliga -seotud valkude positiivset ekspressiooniCD9, CD63 ja ALIXpuhastatud ekstratsellulaarsetes vesiikulites.

Need tulemused kinnitasid, et puhastatud väikesed ekstratsellulaarsed vesiikulid sisaldasid eksosoome, mis näitab, et seda meetodit saab kasutada kaeksosoomi eraldamine ja ekstraheerimine.

 

 

Järeldus: TFF kombineeritud ultratsentrifuugimisega kvaliteetse{0}}sEV ettevalmistamiseks

Uuring näitas sedaAinult TFF-i kontsentratsioontulemuseks oli toode, mis sisaldas märkimisväärses koguses saastavaid valke ja oli seetõttu ebapiisav kvalifitseeritud ekstratsellulaarsete vesiikulite saamiseks.

Samamoodi kasutades a100 kDa ultrafiltratsioonitoru sekundaarseks puhastamiseksei andnud tõhusalt terveid vesiikulite struktuure.

Kombineerides TFF-i kontsentratsiooni järgneva ultratsentrifuugimise puhastamisega, saab mõlema meetodi eelised integreerida, et saadakvaliteetsed-väikesed rakuvälised vesiikulid.

Võrreldes ainuüksi tavapärase ultratsentrifuugimisega võib kombineeritud protsess tõhusalt toimidavähendada üldist töötlemisaega ja parandada eraldamise tõhusust.

Selles töövoosTFF võimaldab suurte{0}}mahuliste näidiste kiiret rikastamist, mis käsitleb tavapärase ultratsentrifuugimise piiranguid suurte proovikoguste töötlemisel. Ultratsentrifuugimine teostab seejärel sügavpuhastuse, et eemaldada ko-kontsentreeritud valgulisandid, aidates samal ajal säilitada vesiikulite puhtust ja terviklikkust.

Lisaks ei nõua protsess lisamisteksogeensed keemilised sadestamise reaktiivid, aidates võimalikult suurel määral säilitada vesiikulite bioloogilist aktiivsust.

Tööstusliku tõlke vaatenurgast on sellel protsessil märkimisväärnesuurendada potentsiaali-ja võib aidata lahendada probleeme, mis on seotud rakuväliste vesiikulite suuremahulise tootmisega-ravimite kohaletoimetamine, regeneratiivne meditsiin ja sellega seotud tootearendus. See annab ka kindla eksperimentaalse aluse protsesside järgnevaks optimeerimiseks ja katse{1}}mahus tootmiseks.

 

Viide

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha jt.Väikeste ekstratsellulaarsete vesiikulite eraldamise meetodi loomine tangentsiaalse voolufiltri abil kombineerituna ultratsentrifuugimisega. Hiina bioloogiaajakiri, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.